《植物生理学》

实习一 长、短日照处理效应

一、技能目标：

观察菊花等短日植物的长、短日照处理效应。

二、原理

暗期的长短是能否开花的关键。菊花是短日照植物，短的光周期诱导能促使其性器官分化，提早开花结实。

三、用品与材料

   供短日处理的暗箱或暗室、日光灯或红色灯泡(60—100W)、光照自控装置、小花盆、双筒解剖镜。

四、方法与步骤

将菊花等短日植物栽培在长日条件下（每天日照时数>16h），当菊花幼苗长出5～6片叶后，按实验表1给以不同处理：

实验表 长、短日照处理方法

经上述处理后，记录菊花现蕾期，并按实验八中介绍的方法剥离生长锥观察顶芽分化情况，并与对照作比较。

实验二 植物组织水势的测定 ( 小液流法 )

一、目的

 学会用小液流法来测定植物组织水势。

 二、原理

当植物组织浸入外界溶液中时，若植物的水势小于外液的水势，则细胞吸水 , 使外液浓度变大；反之 , 植物细胞失水，外液浓度变小，若细胞和外液的浓度相等，则外液浓度不发生变化。溶液浓度不同其比重也不同，不同浓度的两溶液相遇，稀溶液比重小而会上升，浓溶液比重大而会下降。根据此理 , 把浸过植物组织的各浓度液滴滴回原相应浓度的各溶液中，液滴会发生上升、下降或基本不动的现象。如果液滴不动，说明外液在浸过组织后浓度未变，那么就可根据该溶液的浓度计算出其水势。此水势值也就是待测植物组织 水势。小液流法就根据这个原理，把植物组织浸人一系列不同浓度的煎糖液中 , 由于比重发生了变化，通过观察滴出小液滴在原相应浓度中的反应而找出等渗浓度，从而就可算出溶液的水势。

三、用品与材料

指管木架、指形管 ( 带软木塞 )、弯头毛细吸管 ( 带橡皮头 )、小镊子、移液管、温度计、穿孔器、不同浓度的蔗糖液 (0.2～0.6mol/L)、甲烯蓝 ( 亚甲基蓝 )、叶片。

四、方法与步骤

1. 取洗净烘干的指形管10个，分成两组, 各按糖液浓度编记2、3、4、5、6号，插在指管架上，排成两排，使同号相对。在一排管中, 分别注人0.2～0.6mol/L 的蔗糖液各5ml; 另一排管内分别注人对应浓度糖液各1ml时, 两者管口均塞上软木塞。

2. 选取有代表性的植物叶子1至数片, 用打孔器打取叶圆片40片。用小慑子把圆片 放人 1ml 糖液指形管中，每管 8 片，再塞上软木塞。每隔数分钟轻轻摇动，使叶片要全部浸入糖液中，使叶内外水分更好地移动。

3.30～60min 后，打开软木塞，向装叶的每一管中投人甲烯蓝小结晶 1～2 粒 ( 可用 针或火柴杆等挑取甲烯蓝粉少许，要求每管用量大致相等), 摇动均匀，使糖液呈蓝色 (便于观察) 。

4. 用干净毛细管吸取有色糖液少许，轻轻插入同浓度5ml 糖液内，在糖液中部轻轻 挤出有色糖液一小滴，小心抽出毛细吸管，不能搅动溶液，并观察有色糖液的升降情况，分别作下记录。毛细吸管不能乱用, 一个浓度只能用一只，既要干净，又要干燥。找出便有色糖液不动的浓度, 即为等渗浓度。如果找不到静止不动的浓度，则可找液滴上升和下降交界的两个浓度，取其平均值，即可按公式计算出该植物的水势。

5. 计算根据找到的溶液浓度换算成溶液渗透压，可按下列公式计算:

ψs =-P     P = iCRT

式中  ψs—溶质势；

P—渗透压；

I—渗透系数 ( 表示电解质溶液的渗透压为非电解质溶液渗透压的倍数。如蔗糖i=1,       NaCl i=1.8  KNO₃ i=1.69)；

C—溶液的摩尔浓度 ( 即所求的等渗浓度 )；

R—气体常数=0.082；

T—绝对温度 , 即实验时液温 +273。

所求得的 P 值，即为该溶液的渗透压，用大气压表示，换算成 Pa (1 大气压 =LO13 × 105pa), 其负值即为该溶液的溶质势，也就是被测植物组织的水势( 因植物组织处于等渗

溶液中，组织的水势等于外液的溶质势 ) 。

五、作业

1.记录实验结果。

2.记录结果代人公式,算出植物组织水势。

实习三 植物的溶液培养

一、技能目标

明确氮、磷、钾、钙、镁、铁等元素对植物生长发育的重要性，掌握植物溶液培养技术。

二、原理

植物在必需的矿物元素供应下正常生长，如缺少某一元素，便会产生相应的缺乏症。用适当的无机盐制成营养液， 即能使植物正常生长，称为溶液培养。

三、用品与材料

玉米、棉花、番茄、油菜等种子 ; 培养缸 （瓷质、玻璃、塑料均可）、试剂瓶、烧杯、移液管、量筒、黑纸、塑料纱网、精密 pH 试纸（pH5~6）、天平、玻璃管、棉花 （或海绵）、通气装置；硝酸钙、硝酸钾、硫酸钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钠、 硝酸钠、硫酸钠、乙二胶四乙酸二钠、硫酸亚铁、棚酸、硫酸锌、氯化锰、钼酸、硫酸铜。

四、方法步骤

1. 育苗。选大小一致饱满成熟的植物种子，放在培养皿中萌发。

2. 配制培养液 ( 贮备液 ) 。取分析纯的试剂 , 按实验表1 用量配制成贮备液。

实验表1  大量元素、微量元素贮备液配制表（g·L^-1）

注：EDTA Na ( 乙二胶四乙酸二钠 ),EDTA-Na 是隐蔽剂 , 能隐蔽其他元素的干扰。配好贮备液后 , 再按实验表 2配制完全液和缺素液〔每 1000ml 蒸馆水中贮备液用量 (ml) 〕。

实验表 2  完全液和缺素液配制表

用精pH 试纸测定培养液的 pH，根据不同植物的要求，pH 一般控制在 5~6 之间为宜，如 pH>6，则用 1%HCl 调节所需 pH 。

3. 水培装置准备。取 1~3L 的培养缸，若缸透明，则在其外壁涂以黑潦或用黑纸套好，使根系处在黑暗环境，缸盖上应打有数孔，一侧用海绵或棉花，或软木固定植物幼苗，再通有橡皮管，使管的另一端与通气泵连接，作根系生长供氧之用。

4. 移植与培养。将以上配制的培养液中各加 1200ml 蒸溜水，将幼苗根系洗干净，小心穿入孔中，用棉花或海绵固定，使根系全浸人培养液中，放在阳光充沛、温度适宜 (20~25 ℃ ) 的地方。

5. 管理、观察。用精密 pH 试纸检测培养液的pH，用 1% 盐酸调整至 pH5~6 之间，每三天加蒸馆水一次以补充瓶内蒸腾损失的水分。培养液 7－10d 更换一次，每天通气 2 — 3 次或进行连续微量通气，以保证根系有充足的氧气。

实验开始后，应随时观察植物生长情况，并作记录，当明显出现缺素症状时 , 用完全

液更换缺素液，观察缺素症是否消失， 仍作记录。

6. 结果分析。将幼苗生长情况做记录。幼苗生长情况

实验四 叶绿体色素的提取与测量

一、叶绿体色素的提取与分离   

( 一 ) 目的 明确叶绿体色素的种类及其提取和分离的方法。

( 二 ) 原理 高等植物的叶绿体中含有叶绿素 ( 叶绿素 a 和叶绿素 b) 和类胡萝卡素( 胡萝卡素和叶黄素 )。这两类色素均不溶于水,而榕于有机洛剂,故常用酒精或丙酮提取。提取液中的叶绿体色素可用层析法加以分离,因吸附剂对不同物质的吸附力不同,当 用适当洛剂推动时,不同物质的移动速度不同,便可将色素分离。

( 三 ) 用品与材料 托盘天平、培养皿、滤纸、玻棒、烧杯、漏斗、研钵、滴管、漏斗架、坩埚、三角瓶、剪刀、 95% 酒精、汽油、碳酸钙、无水碳酸钠、石英砂。

( 四 ) 实验步骤

1. 色素的提取。将剪碎的鲜叶 8～10g 放入研钵中,加少量石英砂和碳酸钙粉及 95% 酒精 5～10ml 研磨成糊状,再加入 20ml 左右的酒精,充分混匀,以提取匀浆中的色素,3～5min 后,过滤人三角瓶中,加 1Og 左右元水碳酸纳以除去提取液中的水分,将提取液转入另一三角瓶中,加塞待用。

干叶提取,可先取植物新鲜叶片在 105 ℃下杀青，再在 70～80 ℃下烘干，研成粉末 ( 如不及时用, 可避光密闭贮存)。称取叶粉 2g, 放入小烧杯中，加人 95% 酒精 20～30 时，进行浸提 ，浸泡中需要用玻璃棒经常搅动，如气温过低亦可在水浴中适当加热。 待酒精是深绿色时，将溶液过滤到另一烧杯或三角瓶中待用。

2. 色素的分离。取一圆形滤纸，在其中心戳一圆形小孔。另取一张滤纸, 剪成长 5cm 、宽 1.5cm 的纸条, 将它捻成纸芯。将纸芯一端蘸取少量提取液使色素扩散的高度限制在 0.5cm 以内, 风干后再蘸, 反复操作数次。然后将纸芯蘸有提取液的一端插人圆形 滤纸的小孔中, 使与滤纸刚刚平齐 ( 勿突出 )。埔塌内加适量元色汽油, 把插有纸芯的圆 形滤纸平放在上, 使纸芯下端浸入汽油中 , 进行层析。这时纸芯不断吸上汽油，并把其上 的色素一起沿滤纸向四周扩散，不久就可看到被分离的各种色素的同心圆环 , 叶绿素 b 为 黄绿色, 叶绿素 a 为蓝绿色, 叶黄素是鲜黄色, 胡萝卡素是橙黄色。用铅笔标出滤纸上各种色素的位置并注明其名称。

（ 五 ) 注意事项

1. 用于色素分离的提取液浓度应高些, 蘸取提取液的速度不直太快, 风干后再蘸,浓度不高时分离效果较差。

2. 分离图可在暗中保存 , 以免色素被光氧化。

( 六 ) 作业记录以上各项结果,并加以解释。

二、叶绿体色素的理化性质

( 一 ) 目的 从光合色素的结构出发, 认清叶绿体色素的主要理化性质及观察方法。

( 二 ) 原理 叶绿素是一种二竣酸的酯, 可与碱起皂化作用, 产生的盐能溶于水中。 以此法将叶绿素和类胡萝卡素分开。叶绿素与类胡萝卡素都具有共轭双键，在可见光区表现出一定的吸收光谱，可用分光镜检查或用分光光度计精确测定。叶绿素吸收光量子而转变为激发态的叶绿素分子很不稳定, 当它回到基态时, 可以发射出红色荧光。叶绿素分子中的镜可被 H+ 所取代而成为褐色的去镁叶绿素, 后者遇到 Cu+ 可形成绿色的铜代叶绿素, 这种铜代叶绿素在光下不易受到破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸制标本。

( 三 )用品与材料 分光镜、铁三角架、研钵、分液漏斗、酒精灯、石棉网、滴管、小烧杯、试管、试管架、玻棒、移液管、95% 酒精、石油醋、醋酸铜粉、氢氧化锦片、50% 醋酸。

( 四 ) 方法与步骤

将本实验第一项中提取的叶绿体色素溶液用95% 酒精稀释一倍，进行以下实验:

1. 皂化作用。吸取叶绿体色素提取液 5ml 放入试管内, 再加人少量氢氧化钾片，充分摇匀, 片刻后, 加入 5ml 石油醚, 摇匀, 再沿试管壁慢慢加入 l～1.5ml 蒸溜水, 轻轻摇匀, 静置试管架上, 随即可看到溶液逐渐分为两层, 下层是酒精溶液, 其中溶有皂化叶绿素 a 和叶绿素 b ( 还有少量叶黄素 )；上层是石油醚溶液, 其中溶有黄色的胡萝卡素和叶黄素。

将上下两层溶液用分液漏斗分离，分别装人试管内，加塞放于暗处，以供观察吸收光谱用。

2.H⁺ 和 Cu⁺ 对叶绿素分子中镁的取代作用。吸取叶绿体色素提取液约5ml放人试管中, 加入 50% 醋酸数滴，摇匀后，观察溶液的颜色有何变化。

当试管中溶液变成褐色后，倾出一半于另一试管中，投入醋酸铜粉末少许，微微加热，然后与未加醋酸铜的试管比较，观察颜色有何变化。

3. 叶绿素的荧光现象。取较浓的叶绿体色素提取液 5ml, 放人试管中 , 观察光线透过叶绿素提取液和叶绿素提取液在暗背景下的反射光的颜色有何不同?

4. 叶绿体色素的吸收光谱。先调试分光镜, 伸缩分光镜的望远镜筒, 使彩色光谱清晰可见 , 然后把叶绿体色素提取液 ( 盛于试管内 ) 置于光源和分光镜的光门之间, 观察光谱有何变化? 再把经过皂化作用后分离出的绿色溶液和黄色榕液分别置于光源和分光镜之间, 观察光谱有何变化? 试说明其原因。

( 五 ) 注意事项

1. 皂化反应中，须待氢氧化钾充分溶解后才能加入石油醚, 反复用石油醚萃取,待上层黄色完全去除,下层才为叶绿素钾盐。

2. 吸收光谱观察的光合色素浓度应适中。

3. 取代反应时如遇温度低可以在酒精灯上加热, 以加快反应。

( 六 ) 作业  

记录以上各项结果, 并加以解释。

三、叶绿素的定量测定

( 一 ) 实验目的 植物叶绿素的含量与光合作用和氮素营养有密切关系, 因此测定植物叶绿素的含量对合理施肥、育种及植物病理研究有着重要意义。本实验要求掌握用分光光度法测定叶绿素含量的方法。

( 二 ) 原理 分光光度法是根据叶绿素对某一特定波长的可见光的吸收, 用公式计算 出叶绿素量。此法精确度高，还能在未经分离的情况下分别测出叶绿素 a 和叶绿素 b 的 含量。

根据比尔定律, 某有色溶液的光密度 D 与其浓度 C 成正比 , 即 D=KCL,L为液层厚度。

当溶液度以百分浓度为单位, 且液层厚度为1cm 时,K 称为该物质的比吸收系数。

欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a和叶绿素b的含量，只需测定该提取液在某一定波长下的光密度D, 并根据叶绿素a、叶绿素b在该波长下的吸收系数即可求出叶绿素的浓度。为了排除类胡萝卡素的干扰, 所用的单色光应选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。

已知叶绿素a和叶绿素b在红光区的最大吸收峰分别位于663m 和645m,又知在波长663nm下，叶绿素a和叶绿素b的80%丙酮溶液的比吸收数分别为82.04 和9.27；而在波长645m下，分别为 16.75 和 45.6 据此可列出下列关系式:

D₆₆₃=82.04G+9.27C_b         ( 实验式1)

D₆₄₅=16.75Ca+45.60 C_b  ( 实验式2)

实验式 12-1 、实验式 12－2 中D₆₆₃、D₆₄₅分别为叶绿素溶液在波长663m和645m时的光密度，Ca、Cb 分别为叶绿素a和叶绿素b的浓度，以 mg.L^-l 为单位。

解方程式实验式 12-1 、实验式 12－2 得 :

Ca = 12.7 D₆₆₃ – 2.69 D₆₄₅     ( 实验式3)

Cb = 22.9 D₆₄₅ –4.68 D₆₆₃         ( 实验式4)

将Ca和Cb相加,即得叶绿素总量C_T, 即:

C_T = Ca + Cb = 20.2 D₆₄₅ -8.02 D₆₆₃ ( 实验式5)

另外,由于叶绿素a、叶绿素b在 652nm处有相同的比吸收系数(均为34.5), 也可在此波长下测定一次光密度 (D₆₅₂) 而求出叶绿素a和叶绿素b的总量, 即 :

 G = D₆₆₃×1000/34.5

( 三 ) 用品与材料 分光光度计、烧杯、滤纸、移液管、天平、剪刀、试管、漏斗、研钵、容量瓶、 80%丙酮、石英砂、碳酸钙粉。

( 四 ) 实验步骤

1. 提取叶绿素。从植株上选取有代表性的叶片若干,剪碎,称取 0.1g 置于研钵中 ( 室温高时,研钵应置于冰浴中 ), 加少量石英砂和碳酸钙粉,并加人少量 80% 丙酮 先研磨成匀浆 , 再定容至25ml, 摇匀并放在避光处,待残渣发白后过滤,滤液供测定用。

2。测定光密度占取一口径为 1cm 的比色杯, 注入上述叶绿素丙酮溶液,另以 80% 丙酮注人同样比色杯中 , 作为空白对照。在663m 和645m波长下读取光密度D₆₆₃、D₆₄₅,或在 652m 波长下读取光密度D₆₅₂ 。

3. 结果计算。根据测得的光密度D₆₆₃ 、D₆₄₅ ，代人实验式3、实验式 4 和实验式5, 分别计算出叶绿素a 、叶绿素b的浓度和叶绿素总浓度 , 也可根据 D₆₅₂ 代人实验式6 计算出叶绿素a 和叶绿素b的总浓度。求得叶绿素浓度后, 再计算出所测样品中叶绿 素的含量, 单位为 mg.g^-1 。

            叶绿素 a 含量 =Ca ×25/1000—×1/0.1— = O.25 Ca

             叶绿素 b 含量 =0.25 C_b  

叶绿素总含量 =0.25 C_T

( 五 ) 注意事项

1. 测定叶绿素的分光光度计波长和精度必须符合要求, 否则测定结果不佳, 导致在652nm 测得的总量与在663nm、645nm 测定计算的总量差异明显。

2. 提取叶绿素时应避直射光, 操作要迅速；提取出的叶绿素应立即测定, 以免光氧化使含量下降。

( 六 ) 作业

计算叶绿素含量, 完成实验报告。

实验五 滴定法测定呼吸速率

一、技能目标

掌握用广口瓶法测定植物的呼吸速率, 并比较不同萌发阶段小麦种子及幼芽的呼吸速率。

二、原理

在密闭容器中加入一定量碱液 [ 一般用 Ba(OH)₂ ], 并悬挂植物材料, 则植物材料呼吸放出的二氧化碳可为容器中Ba(OH)₂ 吸收, 然后用草酸滴定剩余的碱, 从空白和样品二者消耗草酸溶液之差 , 可计算出呼吸释放的二氧化碳量。其反应如下:

Ba(OH)₂+ CO₂→ BaCO₃ + H₂0

Ba(OH)₂ ( 剩余 )+  H₂C₂0₄ → BaC₂0₄ + 2H₂0

三、用品与材料

广口瓶测呼吸装置、电子天平、酸式和碱式滴定管、滴定管架、温度计、尼龙网制小篮、 1/44mol·L^-1  草酸溶液 ( 准确称取重结晶H₂C₂0₄·2H₂0 2.8651g 溶于蒸溜水中 , 定容至1000ml 时, 每毫升相当于 1mg 二氧化破 )、0.05mol·L^-1 氢氧化钡溶液 [Ba(OH)₂ 28.6g 或Ba(OH)₂· 8H₂0 15.78g 溶于 100Oml 蒸溜水中。如有浑浊, 待溶液澄清 后使用 ] 、酚酞指示剂 ( 称取 1g酚酞, 溶于 100ml 95% 乙醇中 , 贮于滴瓶中 ) 。

方法与步骤

1. 装配广口瓶测呼吸装置。取 500ml 广口瓶 1 个, 加二个三孔橡皮塞。一孔插人一 装有碱石灰的干燥管, 使吸收空气中的二氧化碳, 保证在测定呼吸时进入呼吸瓶的空气中 无二氧化碳；一孔插人温度计；另一孔直径约 1cm, 供滴定用。平时用一小橡皮塞塞紧。 在瓶塞下面装一小钩, 以便悬挂用尼龙窗纱制作的小筐, 供装植物材料用。

2. 空白滴定。拔出滴定孔上的小橡皮塞、用碱滴定管向瓶内准确加入0.05mol·L^-1  氢氧化钡溶液溶液 20ml, 再把滴定孔塞紧。充分 摇动广口瓶几分钟。待瓶内二氧化碳全部被吸收后, 拔出小橡皮塞 加入酚酞三滴, 把酸滴定管插人孔中, 用 l/44mol-L-1 草酸进行空白滴定, 至红色刚刚消失为止, 记下草酸溶液用量 (ml), 即为空 白液滴定值。

3. 材料滴定值的测定。取另一广口瓶测呼吸装置,加 20ml Ba(OHb 溶液于瓶内, 取待测小麦种子100 粒,向时称出重量 , 装 人小筐中 , 打开橡皮塞 , 迅速挂于橡皮塞的小钩上 , 塞好塞子 ( 加样操作时, 应严格防止室内空气和口中呼出的气体进入瓶内 ), 开始记录时间。经3Omin, 其间轻轻摇动数次,使溶液表面的BaCO₃薄膜破碎 , 有利于二氧化碳的充分吸收。到预定时间后 , 轻轻打开瓶塞 , 迅速取出小筐, 立即重新塞紧。充分摇动 2min, 使瓶中二 氧化碳完全被吸收,拔出小橡皮塞,加人酚酞3 滴, 用草酸滴定如 前。记下草酸用量 , 即为样品滴定值。

4．取出广口瓶中的小麦种子 , 放于烘箱中于80 ℃下烘干,并称取干重。

  5. 计算呼吸速率:

( 空白滴定值一样品滴定值 ) × mg 二氧化碳· ml^-1 草酸 /（植物组织鲜重×时间）    

 呼吸速率的单位一般可采用 mg·g^-1 · h^-1,

式中滴定值以毫升计,mg 二氧化碳·ml^-1 草酸 = 1 。

( 二 ) 不同状态植物种子呼吸速率的比较

1．描述过的大小一致的广口瓶3个 ( 可三个实验小组合作 ), 按步骤3、4分别测定以下材料的呼吸速率 :

吸胀的小麦种子100 粒；

萌动的小麦种子100 粒；

芽长 0.5cm 左右的小麦种子 100 粒。

根据测定结果 , 按实验式 1计算以鲜重(或干重 ) 为单位的呼吸速率。同时按实验式2计算每 100 粒小麦种子 lh 内放出的二氧化碳毫克数。

      呼吸速率 = (空白滴定值一样品滴定值) ×mg二氧化碳·ml^-1 草酸/测定时间

2. 把不同处理的测定结果记人实验表 , 并加以解释 ,比较用三种不同单位所表示的种子呼吸速率的差异。

实验表  呼吸速率测定记载表

( 三 ) 注意事项

实验课中由于人数多, 室内空气中二氧化碳浓度不断升高 ,是本实验最大的误差来源。若先做样本测定 , 后做空白滴定, 测定结果甚至出现负值。克服的办法可将广口瓶装满水, 在室外迎风处将水倒净, 换上室外空气 ( 若用自来水 , 还应用无二氧化碳蒸馆水或 煮沸过的冷开水洗涤广口瓶 ), 塞好橡皮塞 , 带回室内进行加液、滴定等操作。进行样本 测定时也可在室外将装有萌发种子的小筐挂人瓶中 , 并开始记时。操作要注意到匆使口中呼出的气体进入瓶中。

作业

比较不同类型种子的呼吸强度。

实验六 种子生活力的快速测定

技能目标 掌握种子生活力的快速测定。

一、氯化三苯基四氮唑法 (TTC 法 )

( 一 ) 原理 凡生活种胚在呼吸作用过程中都有氧化还原反应 , 而无生命活力的种胚则无此反应。当 TTC 溶液渗入种胚的活细胞内, 并作为氢受体被脱氢辅酶 (NADH 或 NADPH) 上的氢还原时, 便由无色的 TTC 变为红色的三苯基甲 (TTC) 从而使种胚着色。当种胚生活力下降时, 呼吸作用明显减弱 , 脱氢酶的活性亦大大下降, 胚的颜色变化 不明显, 故可由染色的程度推知种子生活力强弱。

（ 二 ） 用品与材料  恒温箱、培养皿、刀片、烧杯、镊子、天平、0.5%TTC 溶液。

    称取0.5gTTC放在烧杯中, 加人少许 95% 乙醇使其溶液, 然后用蒸榴水稀释至100ml 。溶液避光保存 , 若溶液变红色 , 即不能再用。

( 三 ) 方法与步骤

1. 浸种。将待测种子在 30～35 ℃温水中浸泡 ( 大麦、小麦、籼谷 6～8h , 玉米 5h左右, 梗谷2h), 以增强种胚的呼吸强度, 使显色迅速。

2. 显色。取吸胀的种子200粒, 用刀片沿种胚中央纵切为两半, 取其中的一半置于 两只培养皿中, 每皿100个半粒, 加适量 TTC 溶液, 以浸没种子为度。然后放人 30～35 ℃的恒温箱中保温 0.5～1h 。倒去TTC 溶液, 用水冲洗多次 , 至冲洗液无色为止。观察结果, 凡被染成红色的为活种子。

将另一半在沸水中煮 5min 杀死种胚, 作同样染色处理, 作为对照观察。

计算活种子的百分率, 如果可能的话与实际发芽率作一比较, 看结果是否相符

二、红墨水染色法

( 一 ) 原理 凡生活细胞的原生质膜具有选择性吸收物质能力, 某些染料如红墨水中的酸性大红 G 不能进入细胞内, 胚部不染色。而死的种胚细胞原生质膜丧生了选择用的能力， 于是染料便能进入死细胞而使胚着色。故可根据种胚是否染色来判断种子的主力。

（ 二 ） 用品与材料  与TTC法相同。红墨水溶液的配制:取市售红墨水稀释 20 倍（1份红墨水加19份自来水）作为染色剂。

( 三 ) 方法与步骤 

1.浸种。同TTC法。

2.染色。取巳吸胀的种子200 粒, 沿种胚的中线切为两半, 将其中一半平均分置两只培养皿中, 加人稀释后的红墨水,以浸没种子为度,染色曲也却 min。倒去红墨水液, 用水冲洗多次, 至冲洗液无色为止。观察染色情况：凡种胚不着色或着色很浅的为种子；凡种胚与胚乳着色程度相同的为死种子。可用沸水杀死另一半种子作对照观察。

3.计数种胚不着色或着色浅的种子数, 算出发芽率。

( 四 )作业

1. 试验结果与实际情况是否相符?为什么?

2.TTC法和红墨水法测定种子生活力结果是否相间? 为什么?

实验七  花粉生活力的观察

技能目标 掌握鉴定花粉生活力的几种常用方法。

一、花粉萌发测定法

( 一 ) 原理 正常成熟花粉粒具有较强的活力, 在适宜的培养条件下能萌发和生长在显微镜下可直接观察与计数萌发个数, 计算其萌发率, 以确定其活力。

( 二 ) 器材与用具 显微镜、恒温箱、培养皿、载玻片、玻棒、滤纸。

培养基（10%蔗糖，10mg·L-1硼酸，0.5%琼脂）：称10g蔗糖，1mg硼酸，0.5g琼脂与90ml水放入烧杯中，在100℃水浴中溶化，冷却后加水至100ml备用。

（三）方法与步骤

1．培养花粉。将培养基熔化后，用玻璃棒蘸少许，涂布在载玻片上，放入垫有湿润滤纸的培养皿中，保湿备用。

采集丝瓜、南瓜或其它葫芦科植物刚开放的成熟花朵，将花粉洒落在涂有培养基的载玻片上，然后将载玻片放置于垫有湿滤纸的培养皿中，在25℃左右的恒温箱(或室温 20 ℃ ) 下培养5～10min。

2. 观察。用显微镜检查5个视野, 统计萌发花粉个数。

二、碘—碘化钾染色测定法

（ 一 ) 原理  大多植株正常成熟的花粉呈圆球形, 积累着较多的淀粉, 用碘—碘化钾溶液染色时,呈深蓝色。发育不良的花粉往往由于不含淀粉或积累淀粉较少, 碘—碘化钾溶液染色时呈黄褐色。故可用碘—碘化钾榕液染色法来测定花粉活力。

( 二 ) 器材与用具  显微镜、天平、载玻片与盖被片、镊子、烧杯、量筒、棕色试剂瓶。

碘—碘化钾溶液:取2g碘化钾溶于 5～10ml蒸溜水中,加人1g碘,充分搅拌使完全溶解后, 再加蒸溜水300ml时, 摇匀贮于棕色试剂瓶中备用。

( 三 ) 方法与步骤

1. 制片与染色。采集水稻、小麦或玉米可育和不育植株的成熟花药 , 取一花药于载玻片,加1滴蒸溜水,用慑子将花药捣碎, 使花粉粒释放。再加1-2滴碘—碘化钾溶液 , 盖上盖玻片。

2. 观察。观察2-3张片子, 每片取5个视野, 统计花粉的染色率, 以染色率表示花粉的育性。

三、氯化三苯基四氮唑法 (TTC 法 )

( 一 ) 原理 具有活力的花粉呼吸作用较强, 其产生的NADH或 NADPH能将无色的TTC 还原成红色的TTC而使花粉本身着色。无活力的花粉呼吸作用较弱,TTC 颜色 变化不明显, 故可根据花粉着色变化来判断花粉的生活力。

( 二 ) 用品与材料  

显微镜、恒温箱、烧杯、量筒、天平、镊子、载玻片与盖玻片、棕色试剂瓶。

05%TTC 溶液: 称取 0.5gTTC 放入烧杯中,加少许95%酒精使其溶解, 然后用蒸溜水稀释至 100ml,贮于棕色试剂瓶中避光保存(若溶液已发红,则不能再用 ) 。

( 三 ) 方法与步骤

1.染色。采集植物花粉,取少许放在载玻片上, 加1～2 滴0.5% TTC溶液,盖上盖玻片,置 35 ℃恒温箱中,10～15min 后镜检。

2.镜检。观察2-3张片子,每片取5个视野镜检,凡被染红色的花粉活力强,淡红次之,无色者为没有活力或不育花粉,统计花粉的染色率, 以染色率表示花粉活力的百分率。

四、作业

1. 上述每一种方法是否适合于所有植物花粉活力的测定?

实验八 不良环境对植物的影响（电导法）

一、技能目标：

了解不良环境对植物细胞的伤害与电导率的关系。

二、原理

当植物受低温、高温等不良条件影响时，会引起细胞膜选择透性的丧失，使细胞内的盐类和有机物外渗到周围介质中。电解质的外渗，可以很容易用电导率仪测出。

三、用品与材料 

    柳树枝条、冰箱、烧杯、剪刀、电导仪、天平、真空泵蒸馏水或无离子水、量筒、镊子。

四、方法与步骤

(一)电导率的测定 

称取经冰冻和未冰冻的清洗材料各1份，叶子为2．0g(不含粗叶脉)，枝条3.0g。叶片剪成1㎝²左右的方块，枝条剪成1cm长的小段，放人干净烧杯内。先用自来水反复和浸洗几分钟，以便洗去伤口表面的电解质，再用去离子水清洗三四遍，最后用50ml去离子浸泡，加盖，放置1h后，测出电导率。同时用蒸馏水作空白对照，测出电导率。

    将上述材料煮沸1～2min，静置1h，测定电导率。同时用蒸馏水作空白对照，测出电导率。分别计算受冻与未受冻材料电解质外渗的百分率。

(二)植物受伤害的百分率的计算  

受冻与未受冻材料电导率，分别为A与B，煮沸后电导率分别为C与D，一般情况下(当两份材料非常均匀时)，C与D大致相同，单位均为μS/cm。

    受冻材料的相对电导率（%）=A／C×l00

    未受冻材料的相对电导率（%）=B／D×l00

    植物受伤的百分率（%）(A－B)／(C－B)×100

    比较受冻材料与未受冻材料的相对电导率的大小，相对电导率越大，受害程度越大，看看与植物受伤的百分率结果是否相符。

 五、作业

    1．当测定出的电导率C与D的值相差较大时，说明了什么问题？

2．简述电导率仪的使用方法及注意事项。

实验九 质壁分离法测定渗透势

一、技能目标

通过实验学会用质壁分离测定植物细胞或组织的渗透势。

二、原理

植物细胞是一个渗透系统，如果将其放人高渗溶液中，细胞内水分外流而失水，细胞会发生质壁分离现象，细胞在等渗或低渗溶液中则无此现象。细胞处在等惨榕液中，此时细胞的压力势为零，那么细胞的渗透势就等于溶液的渗透势即为细胞的水势。

当用一系列梯度的糖液观察细胞质壁分离时,细胞的等渗浓度界于刚刚引起初始质壁分离的浓度和与其相邻的尚不能引起质璧分离的浓度之间的溶液浓度 , 代人 ψ_π = -iCRT 公式，即可算出其渗透势 ( 即水势 ) 。

三、用品与材料

显微镜、载玻片、盖玻片、培养皿 ( 或试管 ) 、慑子、刀片、表面皿、试管架、小玻棒、吸水纸、 0.2～0.6mol·L^-1 的蔗糖、 0.03% 中性红、小麦叶片 ( 最好为含有色素的植物材料，如带色的洋葱表皮、紫鸭跖叶片等 )。

四、方法与步骤

1. 取干燥洁净的培养皿 5 套，贴上标签编号，依次倒人不同浓度的糖液 (0.2～0.6mol·L^-1 ), 使其成一薄层 , 盖好皿盖。

2. 以镊子撕取叶表皮或洋葱鳞茎内表皮放人中性红皿内染色 5～10min( 有色材料不染色 ), 取出后用水冲洗，并吸干植物材料表面的水分，然后依次放人不同浓度糖液中，经过 20～40min 后 ( 如温度低， 适当延长 ), 依次取出放在载玻片上，用玻棒加一滴原来浓度的糖液，盖上玻片，在显微镜下观察质壁分离情况，确定引起50% 左右细胞初始质 壁分离时的那个浓度 ( 即原生质从细胞角隅分离的浓度 ) 作为等渗浓度。

3. 实验结果做记录。

五、作业

1. 记录实验结果。

2. 算出所测植物组织的渗透势。

实习十 植物光合速率的测定

一、实验目的

掌握改良半叶法测定叶片净光合速率、总光合速率的原理和方法。

二、原理

叶片中脉两侧的对称部位 , 其生长发育基本一致 , 功能接近。如果让一侧的叶片照光 , 另一侧不照光 , 一定时间后 , 照光的半叶与未照光的半叶在相对部位的单位面积干重 之差值 , 就是该时间内照光半叶光合作用所生成的干物质量。

在进行光合作用时 , 同时会有部分光合产物输出 , 所以有必要阻止光合产物的运出。 由于光合产物是靠韧皮部运输 , 而水分等是靠木质部运输的 , 因此如果破坏其韧皮部运输 , 但仍使叶片有足够的水分供应 , 就可以较准确地用干重法测定叶片的光合强度。

三、用品与材料

打孔器、分析天平、称量皿、烘箱、脱脂棉、锡纸、毛巾、 5% 三氯乙酸、 90 ℃以上的开水、剪刀、纸牌。

四、方法与步骤

（ 一 ） 选择测定样品 在田间选定有代表性的叶片若干 , 用小纸牌编号。选择时应注意叶片着生的部位、受光条件、叶片发青是否对称等。

( 二 ) 叶子基部处理 棉花等双子叶植物的叶片 , 可用 5% 三氯乙酸涂于叶柄周围 ; 小麦、水稻等单子叶植物 , 可用在 90℃以上开水浸过的棉花夹烫叶片下部的一大段叶鞘 20s 。如玉米等叶片中脉较粗壮 , 开水烫不彻底的 , 可用毛笔蘸烧至 110～120 ℃的石蜡烫其叶基部。为使烫伤后的叶片不致下垂 , 可用锡纸或塑料包围之 , 使叶片保持原来着生的角度。

（ 三 ）剪取样品 叶子基部处理完毕后 , 即可剪取样品 , 一般按编号次序分别剪下叶 片的一半 ( 不要伤及主脉 ), 包在湿润毛巾里 , 贮于暗处 , 也可用黑纸包住半边叶片 , 待测定前再剪下。

    过4～5小时，再按原来次序依次剪下照光另半边叶，也按编号包在湿润的毛巾中。

（ 四 ） 称重比较 用打孔器在两组同号的半叶的对称部位打若干圆片 ( 有叶面积仪的 , 也可直接测出两半叶的叶面积 ), 分别放人两个称量皿中 , 在 110 ℃下杀青 15min, 再 置于 70 ℃烘箱至恒重 , 冷却后用分析天平称重。

( 五 ) 结果计算 两组叶圆片干重之差值 , 除以叶面积及照光时间 , 得到光合强度

( 实验式 13－1), 即 :光合速率 = (W2－W1) /S×T (mg·dm^-2·h^-1)

W2—照光圆片干重 (mg );

W1—未照光圆片干重 ( mg );

S —圆片总面积 (dm)

t —照光时间 (h) 。

( 六 ) 注意事项

1. 选择外观对称的植物叶片 , 以免两侧叶生长不一致 , 导致误差。

2. 选择的叶片应光照充足 , 防止因太阳高度角的变化而造成叶片遮阳。

3. 涂抹三氯乙酸的量或开水烫叶柄的时间应适度 , 过轻达不到阻止同化物运转的目的, 过重则会导致叶片萎焉降低光合。

4. 应有若干张叶片为一组进行重复。

实验十一 植物缺素症状的观察

一、技能目标

学习溶液培养的方法 , 证实氮、磷、钾、钙、镁、铁诸元素对植物生长发育的重要性和缺素症状。

二、原理

植物在必需的矿物元素供应下正常生长，如缺少某一元素，便会产生相应的缺乏症。用适当的无机盐制成营养液， 即能使植物正常生长，称为溶液培养，如果用缺乏某种元素的缺素液培养，植物就会呈现缺素症状而不能正常生长发育。将所缺元素加人培养液中，该缺素症状又可逐渐消失。

三、用品与材料

玉米、棉花、番茄、油菜等种子 ; 培养缸 （瓷质、玻璃、塑料均可）、试剂瓶、烧杯、移液管、量筒、黑纸、塑料纱网、精密 pH 试纸（pH5~6）、天平、玻璃管、棉花 （或海绵）、通气装置；硝酸钙、硝酸钾、硫酸钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钠、 硝酸钠、硫酸钠、乙二胶四乙酸二钠、硫酸亚铁、棚酸、硫酸锌、氯化锰、钼酸、硫酸铜。

四、方法步骤

1. 育苗。选大小一致饱满成熟的植物种子，放在培养皿中萌发。

2. 配制培养液 ( 贮备液 ) 。取分析纯的试剂 , 按实验表1 用量配制成贮备液。

实验表1  大量元素、微量元素贮备液配制表（g·L^-1）

注：EDTA Na ( 乙二胶四乙酸二钠 ),EDTA-Na 是隐蔽剂 , 能隐蔽其他元素的干扰。配好贮备液后 , 再按实验表 2配制完全液和缺素液〔每 1000ml 蒸馆水中贮备液用量 (ml) 〕。

实验表 2  完全液和缺素液配制表

用精pH 试纸测定培养液的 pH，根据不同植物的要求，pH 一般控制在 5~6 之间为宜，如 pH>6，则用 1%HCl 调节所需 pH 。

3. 水培装置准备。取 1~3L 的培养缸，若缸透明，则在其外壁涂以黑潦或用黑纸套好，使根系处在黑暗环境，缸盖上应打有数孔，一侧用海绵或棉花，或软木固定植物幼苗，再通有橡皮管，使管的另一端与通气泵连接，作根系生长供氧之用。

4. 移植与培养。将以上配制的培养液中各加 1200ml 蒸溜水，将幼苗根系洗干净，小心穿入孔中，用棉花或海绵固定，使根系全浸人培养液中，放在阳光充沛、温度适宜 (20~25 ℃ ) 的地方。

5. 管理、观察。用精密 pH 试纸检测培养液的pH，用 1% 盐酸调整至 pH5~6 之间，每三天加蒸馆水一次以补充瓶内蒸腾损失的水分。培养液 7－10d 更换一次，每天通气 2 — 3 次或进行连续微量通气，以保证根系有充足的氧气。

实验开始后，应随时观察植物生长情况，并作记录，当明显出现缺素症状时 , 用完全

液更换缺素液，观察缺素症是否消失， 仍作记录。

6. 结果分析。将幼苗生长情况做记录。幼苗生长情况

五、作业

做一份实验结果报告。